ISOLASI DNA METODE KITCHEN PREPARATION

ISOLASI DNA DENGAN METODE KITCHEN PREPARATION

I.       Tujuan

1.      Melakukan isolasi DNA melalui metode kitchen preparation

2.      Mengetahui ujud/ profil DNA

II.    Landasan Teori

DNA dapat diisolasi dari berbagai sel atau jaringan baik hewan, tumbuhan maupun manusia. Isolasi DNA merupakan teknik awal dalam pemanfaatan DNA untuk berbagai tujuan. Sebenarnya telah ada metode standar dalam mengisolasi DNA, misalnya teknik atau metode yang dikemukakan oleh Sambrook (1989). Isolasi DNA dari sel maupun jaringan eukariotik, misalnya dari jaringan tumbuhan maupun hewan dilakukan melalui tahap penghancuran sel (lisis), penghilangan RNA dan protein serta pemurnian DNA. isolasi DNA ini membutuhkan alat-alat canggih dan bahan-bahan yang cukup mahal, misalnya EDTA ( Etilendiamin tetra asetat ) yang berfungsi sebagai merusak sel dengan cara mengikat ion Magnesium yang berfungsi mempertahankan integritas sel, SDS ( Sodium dodesil sulfat ) yang dapat melarutkan membrane sel, mendenaturasi protein, enzim proteinase K yang mendegradasi protein, RNAse mendegradasi RNA serta NaCl dan chloroform untuk memurnikan DNA.

Modifikasi teknik isolasi DNA telah dilakukan pada beberapa laboratorium, misalnya pada takaran bahan-bahan yang digunakan atau penguraian/ penggantian jenis bahan yang digunakan sesuai denga sel/ jaringan sumber DNA. Teknik/ metode isolasi DNA yang sangat sederhana adalah metode Kitchen Preparation. Metode isolasi ini memanfaatkan bahan-bahan yang biasanya digunakan ibu rumah tangga yaitu sabun cuci (cair, bubuk atau krim) untuk menggantikan bahan utama yang berfungsi untuk melisis sel, ekstrak buah nanas sebagai sumber enzim protease serta garam dapur.

Isolasi DNA metode Kitchen Preparation menggunakan detergen sebagai alternative pengganti EDTA dan SDS, garam dapur sebagai pengganti NaCl analitik dan jus nanas sebagai pengganti enzim protease. Sedangkan bahan yang akan dilihat DNA nya adalah strowberi, hal ini dikarenakan strowberi mudah dihancurkan. Selain itu, strowberi matang menghasilkan enzim pectinase dan selulase yang membantu memecah dinding sel. Strowberi yang umum dibudidayakan adalah octoploid dengan delapan set genom. Hal ini sangat baik untuk menunjukkan ekstraksi DNA karena memiliki delapan dari setiap jenis kromosom yang juga dikatakan bahwa strowberi memiliki DNA yang berlimpah.

III. Alat dan bahan

1.     3  Buah strowberi

2.      1 Kantong plastic

3.     10 ml  Sabun cair/ detergen

4.      Garam

5.      Kertas saring

6.      Tabung reaksi

7.     20 ml etanol dingin (96 %) dimasukkan dalam freezer

8.      Pipet

9.      Gelas ukur

10. corong kaca

11. 1 gelas kimia 250 ml

IV. Cara kerja

1.      Menyiapkan larutan buffer dengan cara mengambil 10 ml sabun cair ditambah dengan seujung sendok teh garam dapur lalu ditambah air sampai larutan menjadi 100 ml.

2.      Memasukkan 2-3 buah strowberi kedalam kantong plastic, kemudian menghancurkan dengan cara menekan-nekan sampai homogen. Kantong plastic jangan sampai bocor.

3.      Mengekstraksi strowberi yang telah dihancurkan dengan saringan kemudian memasukkan hasil ekstraksi tersebut kedalam tabung reksi.

4.      Menambahkan sedikit air sebagai pelarut sampai tinggi larutan 2 cm.

5.      Menambahkan sabun cair dan garam (buffer) kedalam tabung reaksi berisi larutan ekstrak strowberi.

6.      Menghomogenkan larutan dengan cara mengocok tabung reaksi membentuk angka delapan dengan menutup mulut labung reaksi selama 5 menit.

7.      Menambahkan etanol dingin yang baru dikeluarkan dari lemari pendingin kedalam tabung reaksi melalui dinding tabung reaksi secara perlahan-lahan sampai kira-kira sama dengan banyak larutan strowberi.

8.      Mengamati terbentuknya presipitat ( gumpalan putih diatas permukaan atas larutan).

V.    Hasil

Tahap kegiatan	Hasil pengamatan
Strowberi dihancurkan	Strowberi lunak dan berair
Mengektrasi strowberi	Air ekstrasi berwarna merah
Menambah air	Ekstrasi lebih encer
Menambah sabun cair dan garam dapur(buffer)	Larutan berwarna merah kebiruan
Menghomogen larutan	Larutan berwarna kebiruan
Menambahkan etanol dingin	Menjadi 2 lapian, lapisan bawah berwarna biru susu dan lapisan atas putih. Lama kelamaan terjadi presipitasi pita-pita DNA yang berwarna putih di lapisan atas.

VI. Pembahasan

Percobaan isolasi DNA dengan metode Kitchen Preparation yang bertujuan untuk  Melakukan isolasi DNA melalui metode kitchen preparation dan mengetahui ujud/ profil DNA termasuk isolasi DNA kromosom yaitu memisahkan DNA genom dari komponen-komponen sel lain.

Proses peremasan merupakan perlakuan untuk mensederhanakan tekstur dan merusak dinding sel secara mekanis. Strowberi matang menghasilkan enzim yang membantu melisis dinding sel. Sedangkan penambahan sabun cair dan garam dapur adalah untuk melisiskan membrane inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA.

Sebelum menambahkan etanol dingin, larutan berwarna merah tua agak keruh dan belum terjadi presipitasi DNA. Setelah ditambah etanol dingin secara perlahan-lahan terbentuk 2 lapisan . lapisan bawah berwarna merah yaitu larutan strowberi dan larutan sabun, sedangkan lapisan atas berwarna bening yaitu etanol dingin.

Setelah menunggu beberapa saat terjadi presipitasi pada lapisan atas bukan lapisan bawah, yang menunjukkan bahwa DNA tidak larut dalam etanol tetapi larut dalam air. Ketika molekul DNA terlarut, mereka tersebar dalam larutan sehingga tidak terlihat. Ketika molekul tersebut berpindah kedalam larutan yang bukan pelarut meraka akan berkumpul/ menggumpal sehingga dapat dilihat. Presipitat DNA terlihat seperti serabut-serabut putih yang terkumpul diatas permukaan larutan karena masa jenis etanol lebih kecil dari pada masa jenis air. Etanol yang digunakan harus benar-benar dingin dan berasal dari lemari pendingin, hal ini bertujuan untuk menyempurnakan presipitasi. Apabila etanol yang digunakan kurang dingin, maka mengakibatkan pembentukan presipitat kurang sempurna.

VII.    Kesimpulan

      Hasil isolasi DNA metode Kitchen Preparation berupa presipitasi DNA yang berbentuk serabut-serabut berwarna putih yang tidak terlarut dalam etanol tapi terlarut dalam air.

VIII. Daftar pustaka

-    Doyle. J. J and Doyle J. L. 1990. Isolation of Plant DNA from Fresh Tissue Focus. Moscow. 12 (1): 13.

-    Smbrook J, E. F. Fritcs and Manicitis, T. 1989. Molecular Kloning: A Laboratory Manual. 2^nd Edition. Old spring Harbor Laboratory Press. USA.

-    Maftuchah. 2001. Strategi Pemanfaatan Penanda Molekuler dalam Perkembangan Bidang Hortikultura. Makalah Pemanfaatan Penanda Molekuler di Bidang Hortikultura. Plant reportesis 15 : 8- 15.